HPLC分析方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證系統(tǒng)全面講解
一、分析方法開(kāi)發(fā)
分析方法的開(kāi)發(fā)主要包括色譜柱的選擇、流動(dòng)相的選擇、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇和梯度的優(yōu)化幾個(gè)方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相為例進(jìn)行講解。
1.色譜柱的選擇
原料藥生產(chǎn)對(duì)產(chǎn)品的純度和雜質(zhì)含量的要求非?？量?，要求檢測(cè)使用的色譜柱有較高的理論塔板數(shù)，能提供更好的分離度，從而對(duì)可能存在的雜質(zhì)有更大的分離的可能性，所以5um填料的色譜柱長(zhǎng)要250mm，3.5um填料的柱長(zhǎng)要150mm，基本上都是各個(gè)粒徑柱長(zhǎng)最長(zhǎng)的。我比較喜歡近兩年新出的亞二微米填料的色譜柱，50mm柱長(zhǎng)就能提供很高的理論塔板數(shù)，而且柱長(zhǎng)和粒徑小了，流速增加很多，能節(jié)省很多的分析時(shí)間，極大的提高工作效率。一般選用直徑為4.6mm或3.0mm的柱子，太細(xì)了可能會(huì)增大柱外效應(yīng)。填料的孔徑對(duì)于小分子合成藥物不需要考慮，普通的分析柱都在100A左右，能滿足分析檢測(cè)的需要。
對(duì)于API分析方法開(kāi)發(fā)，一般要求必須做色譜柱的篩選實(shí)驗(yàn)，最少使用三種不同類型的色譜柱，每種類型三只，要來(lái)自于不同廠家。
三種類型包括：
1)普通的C18或相應(yīng)的C8色譜柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲羅門(mén)和熱電也有相應(yīng)的色譜柱；
2)封端處理的或者極性嵌入型色譜柱，如Waters的SymmetryShield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲羅門(mén)和熱電也有相應(yīng)的色譜柱；
3)填料用其它官能團(tuán)修飾過(guò)的色譜柱，如苯基柱等，很多公司都有。
一般不同類型的色譜柱在選擇性上會(huì)有很大的差異，相同類型的色譜柱生產(chǎn)廠家不同在選擇性上也會(huì)有差異，這個(gè)主要是填料的性質(zhì)和生產(chǎn)工藝決定的，有時(shí)候用一只色譜柱分離不好，除了優(yōu)化梯度和流動(dòng)相外，換一個(gè)廠家的柱子也是一個(gè)很好的選擇。相同品牌型號(hào)的色譜柱，C18和C8在選擇性上沒(méi)有差異，但是C18保留能力更強(qiáng)，相同的樣品分離度更高，我們一般傾向于選擇用C18。我們?cè)诤Y選色譜柱時(shí)盡量選擇行業(yè)內(nèi)排名前幾位的廠家，柱子品質(zhì)好，開(kāi)發(fā)分析方法時(shí)能省很多力氣，做出來(lái)的分析方法也有保證。一個(gè)藥從開(kāi)發(fā)到上市可能會(huì)持續(xù)十幾年甚至更長(zhǎng)時(shí)間，廠家有實(shí)力，開(kāi)發(fā)方法時(shí)選定的柱子在若干年以后需要時(shí)還會(huì)有的買，做分析時(shí)重復(fù)性也能保障。多用幾只色譜柱做篩選和分析方法優(yōu)化，能盡最大的可能提高分析方法的質(zhì)量，保證檢測(cè)結(jié)果的可信度。
我比較喜歡用的柱子有：Agilent的Zorbax EclipseXDB-C18、ZorbaxEclipse Plus C18，Waters的Symmetry C18、XTerra RP18、XTerra MS C18等，YMC的柱子有時(shí)會(huì)是不錯(cuò)的備用選擇，菲羅門(mén)的柱子菲羅門(mén)的柱子國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)占有率較高，但是感覺(jué)柱子壓力高，壽命短，盡量不用，熱電的柱子用的也不少，但沒(méi)什么感覺(jué)。
制劑分析方法選擇色譜柱的要求基本和API相一樣，對(duì)于中間體和生產(chǎn)過(guò)程中反應(yīng)跟蹤（IPC）分析方法開(kāi)發(fā)使用的色譜柱，我們一般會(huì)根據(jù)樣品性質(zhì)直接選取一兩只普通C18或者封端處理過(guò)的色譜柱，簡(jiǎn)化篩選過(guò)程。
2.流動(dòng)相的選擇
常用做反相流動(dòng)相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價(jià)比的優(yōu)勢(shì)，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長(zhǎng)下有紫外吸收，會(huì)降低分析方法的靈敏度；乙腈雖然價(jià)格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動(dòng)相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長(zhǎng)比甲醇低20nm，增加了檢測(cè)出在低波長(zhǎng)下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有時(shí)候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個(gè)很好的選擇，畢竟不同的溶劑提供不同的選擇性。
對(duì)流動(dòng)相的優(yōu)化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰形、提高分離度。流動(dòng)相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波長(zhǎng)下沒(méi)有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長(zhǎng)下有，但是三氟乙酸易揮發(fā)而磷酸不行，所以單純做液相，低波長(zhǎng)下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運(yùn)行梯度時(shí)基線漂移很嚴(yán)重，而做液質(zhì)就要考慮首選三氟乙酸了，近些年還比較流行加甲酸或乙酸。一般情況下這幾種酸沒(méi)有太大區(qū)別，我們更多的是考慮通過(guò)加酸改變流動(dòng)相的pH值，從而改善樣品的分離度和峰形。下面兩圖是流動(dòng)相的pH值改變對(duì)一組樣品分離和峰形的影響。
從圖中可以看出：
1)流動(dòng)相pH值改變可以改變樣品的保留時(shí)間和分離度；
2)流動(dòng)相pH值改變甚至可以改變某些樣品出峰的先后順序；
3)流動(dòng)相pH值改變可以改變樣品的峰高，即可以調(diào)整峰形。
相同進(jìn)樣量樣品峰越高則意味著峰形越好，從圖中可以看出多數(shù)樣品在低pH值下峰形都比中性要好，這個(gè)主要是由色譜柱本身的性質(zhì)所決定的。色譜柱主要都是硅膠基質(zhì)，現(xiàn)有的填料處理工藝無(wú)法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會(huì)造成樣品峰拖尾，一般認(rèn)為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度。水溶液中添加0.1%（體積）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流動(dòng)相正好抑制硅羥基的活性，所以開(kāi)發(fā)液相分析方法時(shí)流動(dòng)相首選水加01.%的磷酸，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。
在單獨(dú)用酸不行的時(shí)候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)、配制簡(jiǎn)單，需要調(diào)pH值時(shí)要有相應(yīng)的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在10~20mM左右。以前因?yàn)樯V柱填料生產(chǎn)工藝的問(wèn)題，往往需要在流動(dòng)相里添加三乙胺來(lái)減少拖尾，但是三乙胺對(duì)色譜柱的壽命有很大影響，現(xiàn)在新的色譜柱都不再需要了。流動(dòng)相里有時(shí)會(huì)需要調(diào)節(jié)pH值到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定，常用NaOH、KOH溶液或氨水做為調(diào)節(jié)緩沖鹽溶液堿性pH的試劑，也可以往水里單獨(dú)添加氨水做堿性流動(dòng)相。
在緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，出峰太早、峰形很差、相似結(jié)構(gòu)的化合物峰因?yàn)橥衔不蚍逍吞珜挾荒苓_(dá)到基線分離時(shí)，可以考慮使用離子對(duì)試劑，常用的離子對(duì)試劑主要是各種烷基磺酸鈉和四丁基銨鹽，但是流動(dòng)相里使用離子對(duì)試劑時(shí)，系統(tǒng)需要的平衡時(shí)間長(zhǎng)，樣品保留時(shí)間不是很穩(wěn)定，因?yàn)殡x子對(duì)試劑的背景吸收基線會(huì)很差，且做完樣品后需要長(zhǎng)時(shí)間清洗，所以我們盡量不使用離子對(duì)試劑。
使用緩沖鹽時(shí)要注意流動(dòng)相混合以后鹽可能析出的問(wèn)題和鹽背景吸收導(dǎo)致基線漂移嚴(yán)重的問(wèn)題，尤其是在流動(dòng)相里添加醋酸銨以后，在低波長(zhǎng)下梯度變化時(shí)基線下降非常嚴(yán)重，嚴(yán)重影響對(duì)含量較小雜質(zhì)的準(zhǔn)確定量，可以考慮在乙腈里加入10%的水，水中預(yù)先加入10倍水溶液濃度的緩沖鹽，這樣梯度中A、B兩項(xiàng)鹽的濃度相同，可以避免基線漂移嚴(yán)重的問(wèn)題。
原料藥一般結(jié)構(gòu)式比較大，分子構(gòu)成比較復(fù)雜，開(kāi)發(fā)分析方法時(shí)用水加磷酸效果可能效果不好，通常還要求最少嘗試2和6.5兩個(gè)pH值的磷酸鹽緩沖溶液，并依據(jù)結(jié)果對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行pH優(yōu)化，如效果不理想再進(jìn)一步嘗試其它緩沖鹽溶液。開(kāi)發(fā)中間體或者IPC的分析方法時(shí)可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)酌情簡(jiǎn)化流動(dòng)相的選擇過(guò)程。
3.梯度的優(yōu)化
梯度優(yōu)化主要是通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的起始比例和梯度的斜率來(lái)調(diào)整樣品的保留時(shí)間，優(yōu)化樣品的分離度。下圖是梯度中有機(jī)相起始比例的變化對(duì)一組樣品分離的影響。
從圖中可以看出：有機(jī)相起始比例越小，樣品保留時(shí)間越長(zhǎng)，隨著梯度的改變，樣品出峰的先后順序也有可能改變。我們做梯度優(yōu)化時(shí)主要調(diào)整梯度的起始比例和斜率。現(xiàn)在的色譜柱或者采用了新的封端工藝，或者內(nèi)嵌極性基團(tuán)，耐水的能力都比較高。在酸性條件下很多化合物都以離子形式存在，極性較大，為了提高樣品的分離度，盡量使用大比例的水做梯度的起始。對(duì)于添加緩沖鹽的流動(dòng)相要注意梯度變化過(guò)程中流動(dòng)相組成改變時(shí)不能有鹽析出。
對(duì)于水加0.1%磷酸的流動(dòng)相，開(kāi)始時(shí)可以采用95%的水做起始，以95%的有機(jī)相結(jié)束，注意根據(jù)實(shí)際情況在梯度最后用大比例的有機(jī)相沖洗幾分鐘，以保證把小極性的雜質(zhì)洗脫下來(lái)，防止樣品殘留到下一針。梯度的斜率一般采用凹線型的先小后大，梯度變化先慢后快，在此基礎(chǔ)上再對(duì)梯度進(jìn)行優(yōu)化。
使用緩沖鹽溶液的梯度水相起始比例一般要從10~20%開(kāi)始，為了防止鹽析出，在梯度最后避免用純的有機(jī)相做沖洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基礎(chǔ)上根據(jù)方法運(yùn)行的情況對(duì)梯度進(jìn)行調(diào)整。
一般一個(gè)API的樣品采集的時(shí)間控制在40~50分鐘左右，樣品出峰在15~20分鐘左右比較好，如果有極性非常小的雜質(zhì)存在可以在最后加一段時(shí)間的大比例有機(jī)溶劑沖洗色譜柱，最后再設(shè)置10分鐘左右的重新平衡時(shí)間。中間體和IPC的樣品分析方法時(shí)間可以根據(jù)需要減半或者時(shí)間更短。
4.波長(zhǎng)的選擇
做分析方法開(kāi)發(fā)需要二極管陣列檢測(cè)器，做色譜峰純度檢查和選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，通過(guò)色譜峰純度檢查來(lái)保證主峰里沒(méi)有掩蓋其它雜質(zhì)，做純度檢測(cè)對(duì)波長(zhǎng)選擇的要求比較簡(jiǎn)單，原則是把盡量多的雜質(zhì)在色譜圖上體現(xiàn)出來(lái)。很多雜質(zhì)只有在低波長(zhǎng)下才有紫外吸收，所以我們選擇盡可能低的波長(zhǎng)，乙腈的截止波長(zhǎng)在190~195nm，用乙腈做流動(dòng)相檢測(cè)波長(zhǎng)可以選擇在210~220nm。也有公司要求分別選取產(chǎn)品紫外吸收最強(qiáng)的波段和210~220nm兩個(gè)波段做對(duì)比，哪個(gè)純度低以哪個(gè)為準(zhǔn)，這樣可以更嚴(yán)格的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。
二、分析方法驗(yàn)證
為了保證分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對(duì)所采用的分析方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以證明分析方法符合檢測(cè)的目的和要求，這就是分析方法驗(yàn)證。從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過(guò)設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證所采用的分析方法符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。方法驗(yàn)證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測(cè)，方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗(yàn)證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測(cè)目的不同驗(yàn)證要求也不盡相同。
1.專屬性
專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開(kāi)的特性，也稱為選擇性。對(duì)于純度檢測(cè)，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對(duì)于過(guò)程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來(lái)考察有沒(méi)有其它的雜質(zhì)干擾。必要時(shí)使用二極管陣列檢測(cè)器或者質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。
2.線性
線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測(cè)的基礎(chǔ)，需要定量檢測(cè)的項(xiàng)目都需要驗(yàn)證線性。一般用貯備液經(jīng)過(guò)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測(cè)物質(zhì)的濃度（5個(gè)以上），按濃度從小到大運(yùn)行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，考察分析方法的線性。
3.范圍
范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時(shí)，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡(jiǎn)單的說(shuō)，范圍就是分析方法適用的樣品中待測(cè)物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測(cè)的分析方法都需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，純度檢測(cè)時(shí)，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80％～120％。
4.準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度是指測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度，所以也叫做真實(shí)度，需要定量得分析方法均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對(duì)于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定，必要時(shí)可與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。
5.精密度
精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，取樣檢測(cè)次數(shù)應(yīng)至少6次。
精密度可以從三個(gè)層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。
a、重復(fù)性是在相同的操作條件下、較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
b、中間精密度：同一實(shí)驗(yàn)室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時(shí)，測(cè)定結(jié)果的精密度。
c、重現(xiàn)性：指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。
6.檢出限
檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測(cè)定可以通過(guò)對(duì)一系列已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行檢測(cè)，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測(cè)物的最小濃度來(lái)確定，也可把已知濃度樣品的信號(hào)與噪聲信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時(shí)的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。
7.定量限
定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測(cè)的最低量，其測(cè)定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測(cè)的能力。檢測(cè)需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來(lái)確定定量限。
8.耐用性
耐用性是指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動(dòng)因素包括：流動(dòng)相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法有效。
9.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗(yàn)證時(shí)，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動(dòng)相與實(shí)驗(yàn)操作、待測(cè)樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的指標(biāo)。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：分析方法能夠達(dá)到0.05%的檢出限，主峰的拖尾因子0.5<Tf<2.5，主峰與雜質(zhì)的分離度大于2.0，空白干凈，主峰處無(wú)系統(tǒng)峰干擾。
三、總結(jié)
分析方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證是一個(gè)整體，在實(shí)際工作中，一般是先開(kāi)發(fā)分析方法，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗(yàn)證，驗(yàn)證的部分內(nèi)容在分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)就要做，比如說(shuō)分析方法的專屬性驗(yàn)證。分析方法驗(yàn)證并非必須驗(yàn)證所有的內(nèi)容，只要注意驗(yàn)證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測(cè)一般只需要驗(yàn)證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，則不需要驗(yàn)證。
有時(shí)需要對(duì)分析方法進(jìn)行全面或部分的再驗(yàn)證。當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生改變時(shí)，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法的專屬性就需要再進(jìn)行驗(yàn)證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測(cè)新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對(duì)主成份的含量測(cè)定應(yīng)無(wú)干擾。當(dāng)分析方法發(fā)生部分改變時(shí)，如檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生改變，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗(yàn)證，以證明改變后的分析方法的合理性、可行性。
